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　　存在有害效果的可能性是这种复杂组合物的另一种结果。过敏性休克虽是不常发生的问题，但一旦发生就足以造成严重问题。这些缺点已由Brown(《小核糖核酸病毒感染和检测的分子方面》(MolecularAspects of Pic或navirus Infection and Detection)第11章，Semler和Ehrenfeld编，美洲微生物协会Washington，DC，1989，pp 179-191)综合回顾。由于目前FMDV疫苗的复杂组成导致的其它缺点是它不能通过血清学实验分辨被免疫动物和已感染动物(Lubroth等，疫苗，199614419-427)。基于位点特异性免疫原的疫苗将有利于设计分辨疫苗诱导抗体和感染诱导抗体的免疫诊断试剂盒，并因此确保接种程序的有效性。

　　对应于VP1的141-160区域的血清型-特异性肽，也被称为“G-H环”，得自所有七种血清型的FMDV分离株，已显示在豚鼠中诱导保护水平的中和抗体(Francis等，免疫学，1990，69171-176)。显然该区域含有一种主要的免疫原性位点，其也携带病毒的血清型特异性。通过结合于载体蛋白KLH(匙孔帽贝血蓝蛋白)的合成肽实现了对这种141-160VP1肽的免疫原性的最初观察，此过程忽略了生产明确定义的合成免疫原的优点。然而，DiMarchi和Brook(US专利号4732971)表明来源于亚型O分离株的、连接在200-213 Pro-Pro-Ser-141-158-Pro-Cys-Gly嵌合构建体中的两个VP1序列，诱导保护牛抵抗接种的抗体水平，由此他们推动VP1合成免疫原的发展。尽管如此，该肽免疫原的低免疫原性限制了这种作用的功效。需要1-5mg的高剂量才能获得对同型舌头皮下接种的保护，接受5mg剂量的三只动物中的一只没有得到保护。实际应用要求一种仅少量肽免疫原即可对无论同型还是异型接种均提供完全保护作用的疫苗制剂。

　　影响用于FMDV疫苗的合成肽的免疫原性的其它重要因素是呈递给免疫系统一种适合于宿主的T-辅助细胞表位。短的合成肽，只有当它们除含有抗体结合位点之外，还含有与辅助T-细胞受体和II类MHC分子反应的结构域时，才能够了解它们作为疫苗的潜力(Babbitt等，自然，1985，317359-361)。单独的141-160 VP1肽对豚鼠和小鼠具有某种程度的免疫原性，表明该序列中存在适合于这些物种的T细胞表位。相对于这些实验动物的结果，在牛和猪中的疫苗实验表明对该VP1结构域的T-细胞表位的免疫反应性变异太大，所以不能为这些具经济意义的远亲后代种的个体提供适当的保护(Rodriguez等，病毒学，1994，20524-33；和Taboga等，病毒学杂志，1997，712606-2614)。最近，鉴定对应FMDV结构蛋白区域的其它合成肽为T-辅助细胞区域。发现在牛中对应VP1氨基酸21-40的肽能够对VP1中和环结构提供T细胞辅助(Collen等，免疫学杂志，1991，146749-755)；然而，这些T细胞表位不足以给牛提供稳定的保护(Taboga等，1997)。仍然没有关于选择足够的T辅助细胞决定簇的信息，也没有关于已知FMDV疫苗中B-和T-细胞表位的最佳取向。

　　强效Th表位在长度LHRH中的长度范围为约15-约50个氨基酸残基(US 5759551)，通常具有共同的结构特征，可以含有特异性标志序列。例如，共同特征是两性分子螺旋，它是疏水氨基酸残基占据螺旋一面，带电荷和极性残基占据周围面的α-螺旋结构(Cease等，美国国家科学院科学进展，1987，844249-4253)。表位通常含有其它的一级氨基酸模式，例如一个Gly或带电荷残基后跟随两到三个疏水残基，其后依次跟随一个带电荷或极性残基。该模式描述了一种被称为Rothbard序列的模式。另外，Th表位通常遵循1、4、5、8规则，其中一个带正电荷的残基后第四位、第五位和第八位跟随疏水残基。因为所有这些结构由共同的疏水、带电荷和极性氨基酸构成，所以各结构能够在同一个Th表位中同时存在(Partidos等，遗传病毒学杂志(J Gen Virol)，1991，721293-99；Alexander等，免疫学，1994，1751-761)。即使不是全部，但大多数混杂T细胞表位含有至少一个上述周期性。这些特征可以入“理想化人工Th位点”的设计，包括能够在与识别多样化MHC分子有关的位置上提供简并性并保留不变位置的SSAL Th表位。可变位置和优选氨基酸的列表由MHC-结合基元提供(Meister等，疫苗，1995；13581-591)。例如，按照从麻疹病毒F蛋白质中得到一种混杂表位，模拟被称为“SSAL1TH1”的简并Th表位(Partidos等，1991)。将SSAL1TH1(WO 95/11998)设计为与LHRH目标肽顺序连接。象麻疹表位一样，SSAL1TH1遵循Rothbard序列和1、4、5、8规则(参见，例如，SSALTH1中的6、9、10和13位)1 510 15Asp-Leu-Ser-Asp-Leu-Lys-Gly-Leu-Leu-Leu-His-Lys-Leu-Asp-Gly-Leu-Glu Ile Glu Ile Arg Ile Ile Ile Arg Ile Glu IleVal Val Val Val Val Val ValPhe Phe Phe Phe Phe Phe Phe将带电荷残基Glu或Asp加在位置1，以增加Th疏水侧周围的电荷。然后在两性螺旋疏水侧的2、5、8、9、10、13和16位保留疏水残基，2、5、8、9、10、13和16位的可变性提供了一种具有结合广泛MHC限制元件能力的表面。SSAL特征的静作用在于增大了人工Th的免疫抑制的范围(WO 95/11998)。在一个单一的固相肽合成中同时产生该SSAL中的所有变异体，其依次连接目标B细胞表位和其它序列。

　　在考虑潜在环化构象和G-H环的残基表面暴露的基础上，优化含有FMDV VP1(G-H环)的主要中和决定簇的目标抗原序列，如从internet地址为http∥的Brookhaven国立实验室和Acharya等，自然337709-711，1989提供的FMDV VPI的三维结构推测的那样。将环化的侯选位置插入肽构建体的设计，通过连续合成共价结合混杂Th表位以及有或没有其它免疫刺激物质合成修饰的和未修饰的序列。将特定二硫键引入其中，合成环状的修饰肽构建体，以便将易变动的肽稳定成为潜在的更具生物相关性的构象。通过制备超免疫血清和实验该血清在FMDV中和分析中的效力，鉴定含有相关免疫原性的VP1抗原位点的合成构建体。具体地说，通过基于FMDV病毒株A12的VP1蛋白质的氨基酸序列的表位作图选择本发明的目标抗原位点(实施例2)。

　　目标VP1位点是短肽序列。当合成它们自身作为本发明的肽时，这些肽通常具有较弱的免疫原性。通过化学连接来源于外源病原体的混杂Th表位，这些短肽可以被免疫加强，所述外源病原体包括但不限于，例如，乙肝病毒表面和核心抗原辅助T细胞表位(HBs TH和HBc Th)、百日咳毒素辅助T细胞表位(PT Th)、破伤风毒素辅助T细胞表位(TT Th)、麻疹病毒F蛋白辅助T细胞表位(MVFTh)、沙眼衣原体主要外膜蛋白辅助T细胞表位(CT Th)、白喉毒素辅助T细胞表位(DTTh)、镰状疟原虫环孢子体辅助T细胞表位(PF Th)、曼森氏血吸虫三糖磷酸盐异构酶辅助T细胞表位(SM Th)，及大肠杆菌TraT辅助T细胞表位(TraT.Th)。病原体衍生的Th在US 5759551中的SEQ ID NOS2-9和42-52列出；衣原体辅助位点P11在Stagg等，免疫学，1993，791-9中列出；HBc肽50-69在Ferrari等，临床研究杂志，1991，88214-222中列出，它们经参考插入本文。混杂Th还包括来源于FMDV蛋白质的自体固有Th表位(表5，例如，SEQ ID NO24)，被参考插入本文，或者设计的人工Th表位，如表6所示(例如，SEQ ID NOS25、26、36、37、和38)。

　　对于主动免疫，本文中所指的术语“免疫原”涉及能够诱导抗FMDV的VP1蛋白质上存在的G-H环区抗体的肽组合物，产生对多种血清型FMDV的有效中和，因此预防FMDV感染。本发明的肽组合物优选包括含有混杂辅助T细胞表位(Th表位)和任选地其它免疫刺激物质的合成肽。Th肽经间隔区(例如，Gly-Gly)共价结合于FMDV VP1目标抗原区(例如，SEQ ID NOS1-21、35)，从而结合于目标抗原位点的N-或C-末端，以便诱导有效的抗体应答。免疫原还可以包括一般性免疫刺激氨基酸序列，例如，相应于源自耶尔森氏鼠疫杆菌属的侵染素蛋白的结构域(Brett等，欧洲免疫学杂志，1993，231608-1614)(SEQ ID NO22)。如果存在，一般性免疫刺激结构域可以包括一种间隔区，用于通过肽结合。

　　如果A为一种侵染素的结构域，则它可以是来自耶尔森氏鼠疫杆菌种侵染素蛋白的免疫刺激表位。这种免疫刺激特性来源于这种侵染素结构域与T细胞，特别是活化的免疫或记忆T细胞上存在的β1整联蛋白分子相互作用的能力。Brett等描述了与β1整联蛋白相互作用的侵染素结构域的特定序列(欧洲免疫学杂志，1993；231608)。在US 5759551中已经描述过用于连接混杂Th表位的侵染素结构域(Inv)的一种优选实施方式，其经参考插入本文。Inv结构域优选具有如下序列Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-Gln-Phe(SEQ ID NO22)，或为来源于另一种耶尔森氏鼠疫杆菌种侵染素蛋白相应区域的其免疫刺激类似物。因此这种类似物可以含有氨基酸残基的取代、删除或插入，以适应株系变异，只要类似物保留免疫刺激特性。(A)n优选包括一种间隔区，例如Gly-Gly，通过它所述侵染素结构域与肽连接。在一个优选实施方式中，(A)3依次为一种侵染素结构域(Inv)、甘氨酸和甘氨酸，即(Inv)-Gly-Gly。

　　B为一种间隔区，是一种上述的天然氨基酸或非天然氨基酸。每个B独立地相同或不同。B的氨基酸还可以在混杂Th表位和FMDVVP1抗原位点(例如，SEQ ID NOS1-21和35)或其反应性和免疫功能类似物之间提供一种间隔区，例如Gly-Gly。除了使Th表位与B细胞表位物理分隔，Gly-Gly间隔区可以破坏Th表位与FMDV VP1抗原位点结合产生的所有人工二级结构，因此减弱了Th和/或B细胞应答之间的干扰。B的氨基酸还可以构成一种作为增强Th和FMDVVP1目标抗原位点分隔作用的柔韧性绞链的间隔区。在免疫球蛋白重链绞链区中发现了编码柔韧性绞链的序列的实例。柔韧性绞链序列通常富含脯氨酸。一种特别有用的柔韧性绞链为序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SFQ ID NO23)，其中Xaa为任意氨基酸，优选为天冬氨酸。由B的氨基酸提供的构象间隔使本发明的肽免疫原和合适Th细胞和B细胞之间的相互作用更为有效，由此增强了对Th表位和抗体-诱导性表位以及它们的交叉相互反应性和免疫功能类似物的免疫应答。

　　Th是一种含有Th表位的氨基酸序列(天然或非天然氨基酸)。Th表位可以由连续或不连续表位构成。因此不是Th的每一个氨基酸一定是表位的一部分。因此，Th表位，包括Th表位的类似物和片段，能够增强或刺激对FMDV VP1抗原位点(例如，SEQ ID NOS1-21和35)及其免疫功能类似物的免疫应答。表现为免疫结构域和混杂的Th表位在动物和人群中与广泛的趋异进化MHC型具有高度和广泛的反应性(Partidos等，1991；US 5759551)。本发明肽的Th结构域约具有10到50个氨基酸，优选约具有10到30个氨基酸。当出现多重Th表位(即m≥2)，则每个Th表位独立地相同或不同。Th片段是Th表位的连续部分，其足以增强或刺激对FMDV VP1抗原位点的免疫应答。

　　本发明的肽免疫原可以通过本领域普通技术人员公知的化学合成法制备。参见，例如，Fields等，《合成肽用户指南》第三章，Grant，W.H.编，Freeman和Co.，NY，1992，p.77。因此，可以应用固相合成法——自动匹配Merrifield技术，用t-Boc或Fmoc化合物保护α-NH2，并应用侧链保护的氨基酸，在例如，430A或431型应用生物系统肽合成仪(the Applied Biosystems肽Synthesizer Models 430A或431)上合成肽。可以通过以设计中具体说明的适当比例提供用于结合到一个特定可变位置上的选择氨基酸混合物，制备B或T细胞表位的含有构建的合成抗原文库(SSAL)的肽构建体。

　　或者，较长的合成肽免疫原可以通过公知的重组DNA技术合成。一些关于分子克隆技术的标准手册提供了详细的通过表达重组DNA和RNA制备本发明肽的方法。为了构建编码本发明肽的基因，将氨基酸序列逆向翻译成一种核酸序列，优选利用应用于基因将在其中表达的有机体的优化密码子。接着，制备编码肽的基因，通常通过合成编码肽和必需调控元件的重叠寡核苷酸。将合成基因整合入或插入适当的克隆载体。本发明包括的合成核酸序列包括编码本发明的肽、免疫功能同源物和类似物、以及特征在于非编码序列改变但没有改变被编码肽的免疫特性的核酸构建体的核酸序列。还提供了包含编码本发明肽序列的核酸。将合成基因插入适当的克隆载体，得到重组体并鉴定特征。然后在选择的表达系统和宿主适合的适当条件下表达肽。

　　本发明的另一方面提供了一种在一种药物可接受的传送系统中含有一种免疫有效量的一种或多种本发明的肽免疫原的药物组合物。因此，可以应用佐剂、药物可接受载体或其它疫苗组合物中常规提供的成分将本发明的肽组合物配制成一种疫苗组合物。可以用于本发明的佐剂或乳化剂包括明矾、不完全弗氏佐剂、liposyn、皂甙、角鲨烯、L121、emulsigen、单磷脂酰脂类A(MPL)、二甲基-二-十八烷基溴化氨(DDA)、QS21、ISA206、和ISA 720，以及其它已知的有效佐剂和乳化剂。所述制剂包括速释和/或缓释制剂，以及用于诱导系统免疫性和/或诱导局部粘膜免疫性的制剂，其可以通过，例如，免疫原包封或与微粒共同给药实现。本领域普通技术人员能够容易地确定所述制剂。本发明的疫苗可以通过任何常规途径给药，包括皮下、口服、肌内、或其它非肠道或肠道途径给药。同样，免疫原可以作为单剂量或多剂量给药。本领域普通技术人员能够容易地确定免疫方案。

　　实施例的目标抗原位点肽通过实施例1中描述的固相法合成。举例说明的是从已知病毒分离株修饰得到的线形和环状FMDV VP1抗原位点，包括来自其它FMDV血清型和亚型的类似物和肽同源物(例如，SEQID NOS1-7)和共有区域(例如，SEQ ID NOS8-13)和SSAL肽(例如，SEQ ID NOS14-21和35)。用于这些实施例的每种肽在免疫原元件(例如，SEQ ID NOS30-32)之间具有Gly-Gly间隔区，但本发明的肽还可以含有其它间隔区(例如，SEQ ID NO23)或没有间隔区。Th包括来源于外源病原体例如乙肝病毒的混杂辅助位点，以及其它被参考插入本文的Th，来源于FMDV的自体固有Th(例如，SEQ ID NO24)，和人工Th(例如，SEQ ID NOS25、26、和36-38)。这些实施例的肽还包括一种任选的一般性免疫刺激位点(例如，SEQ ID NO22)。

　　实施例1评价目标抗原肽的典型程序合成肽涉及的FMDV通过Merrifield固相合成技术，在应用生物系统自动匹配肽合成仪(430、431和433A型)上，用Fmoc化合物合成具有来源于FMDV VP1 G-H环区序列的肽。可以通过以表2、3、4、6和10中所示的用于SSAL的设计公式中具体说明的适当比例，或者如果设计公式中没有具体说明则以等摩尔比例，提供用于结合到一个特定可变位置上的选择氨基酸混合物，制备B或T细胞表位的含有构建的合成抗原文库(SSAL)的肽构建体，例如，“O SSAL”(SEQ ID NO19)或“1、4、9 PALINDROMIC Th”(SEQ ID NO26)。完成所需肽免疫原的组装后，应用三氟乙酸按照标准程序处理树脂，以从树脂上切除肽，并使氨基酸侧链上的功能基团脱封闭。对于环状肽，将切除下来的肽在15％ DMSO的水溶液中溶解48小时，以促进半胱氨酸之间链间二硫键的形成。切除、提取和清洗的肽通过HPLC纯化，通过质谱和反相HPLC鉴定特征。将它们用作研制疫苗的免疫原或评价其与免疫动物获得的血清的反应性的抗原底物。

　　基于合成VP1(AA134-168)肽的ELISA在用100μL 5μg/ml FMDV VP1位点肽的10mL NaHCO3缓冲液(pH 9.5)于37℃保温1小时涂布的96孔肽涂布平板中，进行基于肽的ELISA。将250μL 3％重量百分比的明胶PBS溶液加入肽涂布孔中，于37℃保温1小时，以阻断非特异性蛋白结合位点，用含有体积比为0.05％TWEEN 20的PBS冲洗3次，然后干燥。用含有体积比20％的正常山羊血清、重量比1％的明胶、和体积比0.05％的TWEEN的PBS溶液，以1∶20(体积∶体积)的稀释度稀释实验样品，除非另有说明。将100μL稀释样品加入各孔，使其在37℃反应1小时。然后用体积比0.05％TWEEN 20的PBS冲洗各孔6次，除去未结合的标记抗体。将100μL辣根过氧化酶标记的山羊抗-豚鼠或抗猪IgG以预先确定的优化稀释度在体积比1％的正常山羊血清、体积比0.05％的TWEEN 20的PBS中形成的溶液加入各孔，在37℃保温15分钟。用体积比0.05％TWEEN 20的PBS冲洗各孔6次，除去未结合的标记抗体结合物，然后与100μL含有重量比0.04％的间苯二胺(OPD)和体积比0.12％的过氧化氢的柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)反应15分钟。加入100μL 1.0M H2SO4中止反应，测定492nm(A492)的吸收度。在对吸收度进行线性回归分析，并将截止点A492设置为0.5的基础上，计算表示为Log10的ELISA效价。

　　实施例2通过序列信息和免疫刺激元件优化FMDV目标抗原肽表7中描述了7种FMDV VP1血清型A肽。排列它们相应的VP1氨基酸序列，并如表1中那样编号。该组的携带Th的肽具有鉴定作表5中描述的VP1 21-40(SEQ ID NO24)的自体固有FMDV Th，其序列如下Glu-Thr-Gln-Ile-Gln-Arg-Arg-Gln-His-Thr-Asp-Val-Ser-Phe-Ile-Met-Asp-Arg-Phe-Val(SEQ ID NO24)。详细描述了表7中七个构建体中的五个的序列，表示为SEQ ID NOS1、2、和27-29。合成了这些肽，产生的免疫血清进行免疫原性评价。通过肽-ELISA分析了初始免疫5周后得到的血清的FMDV VP1肽的反应性，并通过标准FMDV中和分析，应用病毒株AFP作为目标病毒分析了其中和FMDV血清型A的能力。

　　基于该中和效力的排列顺序，得出下列关于优化的FMDV VP1抗原肽的结论(1)覆盖从134-169位氨基酸残基的较长肽构建体提供较高的中和效力，因此比其它较短序列(AA134-159)(例如，p2224a＞p2228a，p2225c＞p2229c，and p2236c＞p2233c)更为优选；(2)人工环化合成构建体提供更理想的构象，因此比它们的相应非环化构建体(例如，p2223a＞p2229c and p2236c＞p2225c)更为优选；含有免疫刺激元件的合成构建体提供更高的中和效力，因此比没有免疫刺激元件的构建体(例如，p2236c＞p2223a；p2229c＞p2228a；and p2225c＞p2224a)更为优选。

　　实施例5保护性FMDV中和作用的多种血清型混合物表10中描述了具有合成肽p1520b、p1522b、和p1888b(SEQ IDNO33、31和34)的三种SSAL目标抗原肽混合物。该混合物包括连接于人工Th表位“Syn Th(1、2、4)”(SEQ ID NO25)的代表血清型A(SEQ ID NO15，表2)、血清型O(SEQ ID NO19，表3)、和血清型Asia(SEQ ID NO35，表10)的SSAL目标抗原位点。该混合物用于接种3只豚鼠的动物组。将100μg剂量0周在弗氏完全佐剂中，第3周在弗氏不完全佐剂中分3周给药。通过用于FMDV VP1抗原位点的肽ELISA，和FMDV中和分析，其中来自最近一次爆发的未知VP1序列的病毒株，O1-Taiwan用作目标病毒，评价初始免疫之后得到的血清的免疫原性。所有三只猪对免疫均产生高抗-肽反应性的应答(平均FMDV VP1 ELISA效价未3.7Log10)。尽管FMDV 01-Taiwan VP1序列的性质未知，从三次接种的宿主得到的1∶100稀释的浓缩血清证明其具有显著的中和活性，即4.5Log10。该水平的中和活性预测可用于FMDV感染的保护性免疫。基于PlumIsland动物疾病中心，USDA(M或gan和Mo或e，1990)在预测一种疫苗的FMDV保护性质方面积累的大量经验来看，在体外分析中能够中和2Log10FMDV(MPD50)的血清预期在接种宿主中对抗FMDV感染具有有效的保护作用。

　　制备用于诊断实验的试剂盒，其曾在“基于合成VP1(AA134-168)肽的ELISA”实施例1部分中描述过。将平板用相应于病毒株01Campos(p2463＝AA128-158(T→C)-169)和病毒株01Manisa(p2466＝AA128-158(T→C)-169)的VP1肽作为固相抗原涂布。将这些试剂盒用于测试从曾经历FMD爆发9个月的农村畜群收集到的血清样品。将这些畜群按照它们的已知状况分成“可能感染”和“由于接种可能感染”(从经历爆发的区域)、“接种”、和“正常”(从认为没有FMDV的区域)。吸收度显示在或高于强烈反应性对照的吸收度截止点0.2倍的样品记录为反应性。结果如表11所示。

　　本发明涉及一种肽组合物作为免疫原的应用,其中含有的每种肽包含一种来源于口蹄疫病毒(FMDV)VP1衣壳蛋白的目标抗原位点。该抗原位点与一种辅助T细胞表位,以及优选与其它免疫刺激序列共价连接,优选通过直接合成的常规肽键共价连接,用于预防FMDV感染和根除口蹄疫(FMD)。更具体地说,本发明涉及应用该肽组合物作为免疫原,在动物包括猪、牛、羊、山羊和易感野生动物品种中诱导产生高效价多克隆抗体,该抗体能够在体外有效地中和FMDV的多种病毒株或血清型,以及应用该组合物作为疫苗,防止、和/或减少无论何种血清型的FMDV感染的发生率,并因此实现根除FMD。本发明还涉及组合物中应用的肽,以及含有一种或多种该肽的免疫分析和/或诊断试剂盒,以及应用该材料在哺乳动物中诊断FMDV的方法。