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　　然而，近来已经清楚的是通过更复杂调节的可变剪接机制可以导致生腱蛋白C的大同种型中的分子不均匀性增加。例如，据报导生腱蛋白C的额外结构域C展示出比生腱蛋白C的其它可变剪接结构域更受限的表达模式[Carnemolla B等Am J Pathol 1999；1541345-1352]，其中使用免疫组织化学而显示的主要血管周围的染色。生腱蛋白C的C结构域在大部分正常成年人组织中检测不到，而在高级星形细胞瘤[Carnemolla B等Am J Pathol 1999；1541345-1352]和其它肿瘤类型中超表达。对大生腱蛋白C同种型之间的不均匀性的进一步的支持来源于转录分析，它证实大生腱蛋白C转录物的特征在于异质性组成[Katenkamp K等J Pathol 2004；203771-779]。翻译后修饰(例如糖基化)的存在或不存在均可以提供额外水平的复杂性，它们可以改变各蛋白质结构域表面上的某些表位，并且使得它们无法在体外或体内被特异性单克隆抗体进行特异性分子识别。

　　优选特异性结合成员为如在下文更具体地描述的scFv。VH和VL结构域可以通过肽接头连接，例如具有如SEQ ID NO37中所示的氨基酸序列的接头。一般而言，这些接头具有包含一个或多个串连重复基序的氨基酸序列。该基序一般为5个残基的序列，并且优选残基中的至少4个为Gly或Ser。如果5个残基中的4个为Gly或Ser，那么其它残基可以为Ala。更优选5个残基各自为Gly或Ser。优选的基序为GGGGS，SSSSG，GSGSA和GGSGG(分别为SEQ ID NO76，77，78和79)。优选这些基序在序列中相邻，其中在重复部分之间无间隔核苷酸。接头序列可以包含1-5个，优选3或4个重复基序或由它们组成。例如，带有三个处理重复的接头可以具有下列氨基酸序列之一GGGGSGGGGSGGGGS-SEQ ID NO39SSSSGSSSSGSSSSG-SEQ ID NO41GSGSAGSGSAGSGSA-SEQ ID NO42GGSGGGGSGGGGSGG-SEQ ID NO43。

　　抗体该术语描述了无论是天然，还是部分或完全合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖了具有抗体结合结构域或基本上与之同源的结合结构域的任何多肽或蛋白质。抗体的实例为免疫球蛋白同种型及其同种型亚类；包含抗原结合结构域的片段，例如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双抗体。也可以是用单克隆和其它抗体并使用重组DNA技术生产保留原始抗体特异性的其它的抗体或嵌合分子。这类技术可以包括导入编码免疫球蛋白可变区或不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加上框架区的抗体的互补决定区(CDR)的DNA。例如，参见，EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400。可以使产生抗体的杂交瘤或其它细胞进行遗传突变或其它改变，它们可以改变产生的抗体的结合特异性，也可以不改变产生的抗体的结合特异性。

　　分离的该术语是指本发明的特异性结合成员或编码这类结合成员的核酸的状态将符合本发明。成员和核酸为游离的或基本上不含它们与之天然结合的物质，例如它们在其天然环境或通过在体外或体内实施重组DNA技术进行制备时的环境中(例如细胞培养物)被发现的与之结合的其它多肽类或核酸。可以使用用于分离的实际目的的稀释剂或佐剂配制成员和核酸，例如，一般会将所述的成员与明胶或其它载体混合，如果将它们用于包被用来免疫测定的微量滴定板，或在用于诊断或疗法时将它们与药学上可接受的载体或稀释混合的话。特异性结合成员可以是天然或通过异源真核细胞系统(例如CHO或NS0(ECACC85110503)细胞)糖基化的，或它们可以是非糖基化的(例如如果通过在原核细胞中表达产生)。

　　例如，Marks等(Bio/Technology，1992，10779-783)描述了生产抗体可变结构域的常在性组成的方法，其中指向或邻近于可变结构域区的5′末端的共有引物用于连接人VH基因第三框架区的共有引物，以提供缺乏CDR3的VH可变结构域。Marks等进一步描述了如何将这种常在性组成与特定抗体的CDR3结合。使用类似技术，可以使用缺乏CDR的VH或VL结构域常在性组成改组的本发明的CDR衍生的序列，并且可以将完成改组的VH或VL结构域与同源的VL或VH结构域结合成本发明的特异性结合成员。然后可以在合适的宿主系统，例如WO92/01047的噬菌体展示系统中展示常在性组成，以选择合适的特异性结合成员。常在性组成可以由来自104个以上的各成员，例如106-108或1010个成员的任何个组成。

　　在优选的实施方案中，本发明的特异性结合成员与细胞因子缀合。可以生产包含特异性结合成员或其多肽成分(例如抗体的重链或轻链或多链抗体片段，例如Fab)和细胞因子的融合蛋白。因此，例如，本发明特异性结合成员的VH结构域或VL结构域可以与细胞因子融合。一般而言，特异性结合成员或其成分和细胞因子通过肽接头，例如约5-25个残基的肽，例如10-20个残基，优选约15个残基连接。本文中给出了合适的肽接头的实例。优选细胞因子为IL2，更优选为人IL2。细胞因子可以为融合的特异性结合成员或其多肽成分的上游(N-末端)或下游(C-末端)。优选的实施方案为包含本发明特异性结合成员(尤其是抗体分子，例如scFv分子)和IL2的融合蛋白。这类融合蛋白的氨基酸序列和包含编码它们的核苷酸序列的核酸构成了本发明的组成部分。

　　可以选择或构建合适的载体，它们含有合适的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和如果合适的其它序列。如果合适，载体可以为质粒，病毒，例如，噬菌体或噬菌粒。就进一步详细内容而言，例如，参见Molecular Cloninga Laboratory Manual2nd edition，Sambrook等，1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press。在操作核酸，例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA导入细胞和基因表达和蛋白质分析中的任何已知技术和方案具体地描述在Molecular Biology，Second Edition，Ausubel等eds.，John WileySons，1992中。将Sambrook等和Ausubel等披露的内容引入本文作为参考。

　　使用磺基-NHS-SS-生物素(Pierce)使纯化的结构域A1在选择前进行生物素标记。如(Viti F，等Methods Enzymol 2000；326480-505)所述进行生物筛选(biopanning)。简言之，将生物素化的蛋白(终浓度10-7M)与600μl预封闭的ETH-2文库噬菌体一起孵育30分钟。通过添加5.3×10-7链霉抗生物素包被的磁性珠(Dynal)俘获结合的噬菌体。在强洗涤后，通过还原生物素接头中的二硫键洗脱所选择的噬菌体。在TG-1中扩增分离的噬菌体并且通过聚乙二醇沉淀从上清液中浓缩。在三轮的孵育后，通过如Viti F，等Methods Enzymol 2000；326480-505中所述进行ELISA，筛选出144个分离的抗体克隆。将链霉抗生物素包被的ELISA平板(StreptaWell High Bind，Roche)与生物素化的抗原一起孵育，加入诱导性表达scFv抗体的片段的大肠杆菌TG-1单克隆培养物上清液，然后使用M2单克隆抗体，随后使用抗小鼠免疫球蛋白G-HRP缀合物检测结合的抗体。通过实时相互作用分析，使用BIAcore 3000仪来分析具有最高信号的抗体克隆。在蛋白质A-琼脂糖柱上纯化三种最佳克隆，并且通过对各种肿瘤冷冻切片免疫组织化学分析进行测试。

　　使用生物素化的抗原对亲和成熟文库进行生物筛选。在两轮筛选(如上所述，但使用10-8M生物素化的抗原)后，通过ELISA筛选出总计382个抗体克隆。通过M2-ELISA(Scheuermann J等J Immunol Methods2003；276129-134)进一步表征在ELISA中为阳性的69个克隆，以便评价各抗体克隆的koff值。简言之，将含有scFv抗体的上清液加入到包被了抗Flag M2单克隆抗体(SIGMA)的表面上。在添加生物素化的抗原并且孵育至平衡后，加入过量的未生物素化的抗原作为竞争剂。在0，30，60，90和120分钟的竞争时间后，使用链霉抗生物素-HRP缀合物检测剩余的生物素化的抗原级分。

　　使用磺基-NHS-SS-生物素(Pierce)在选择前对纯化的结构域C进行生物素标记。如[Viti F，等Methods Enzymol 2000；326480-505]所述地进行生物筛选，不过是在链霉生物素和抗生物素蛋白包被的平板上使用交替筛选的操作步骤。简言之，将生物素化的蛋白(终浓度10-7M)与600μl预封闭的ETH-2文库噬菌体一起孵育30分钟。在包被了抗生物素蛋白(第1和第3个孵育周期)或链霉抗生物素(第2个孵育周期)的塑料微量滴定平板上俘获结合的噬菌体。在充分洗涤后，通过还原生物素接头中的二硫键洗脱选择的噬菌体。在TG-1中扩增分离的噬菌体并且通过聚乙二醇沉淀从上清液中浓缩。在三轮筛选后，通过如[Viti F，等Methods Enzymol 2000；326480-505]中所述进行ELISA筛选，得到几打的抗体克隆。

　　52.获得结合生腱蛋白C的特异性结合成员的方法，该方法包括通过在亲代VH结构域的氨基酸序列上添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸来提供各自为所述亲代VH结构域的氨基酸序列变体的一个或多个VH结构域，所述的亲代VH结构域选自4A1-F16 VH结构域；3A1-D5 VH结构域；E10 VH结构域；A12 VH结构域；F4G11 VH结构域；P12 VH结构域；D11 VH结构域和F4S VH结构域；任选地，将由此提供的一个或多个VH结构域氨基酸序列变体与一个或多个VL结构域结合，以便提供一个或多个VH/VL的组合；和/或通过在亲代VL结构域的氨基酸序列上添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸来提供作为亲代VL结构域的氨基酸序列变体的VL结构域，所述的亲代VL结构域选自4A1-F16/3A1-D5 VL结构域；E10/A12 VL结构域；F4 VL结构域；G11 VL结构域；P12/D11 VL结构域和F4S VL结构域；将由此提供的一个或多个VL结构域氨基酸序列变体与一个或多个VH结构域结合，以便提供一个或多个VH/VL结构域的组合；并且测试VH结构域氨基酸序列变体或VH/VL组合以鉴定结合生腱蛋白C的特异性结合成员。

　　53.获得结合生腱蛋白C的特异性结合成员的方法，该方法包括提供编码一个或多个包含待被取代的CDR或缺乏CDR编码区的VH结构域的起始核酸，并且将所述的起始核酸与编码VH CDR氨基酸序列的供体核酸结合，所述的VH CDR氨基酸序列选自SEQ ID NO5；SEQ IDNO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO13；SEQ ID NO18；SEQ ID N019；SEQ ID NO20；SEQ ID NO26；SEQ ID NO27；SEQ ID NO61；SEQ IDNO62；SEQ ID NO63；SEQ ID NO64；SEQ ID NO65；和SEQ IDNO66，由此将所述的供体核酸插入起始核酸中的CDR区，以便提供编码VH结构域的产物核酸；表达所述产物核酸的核酸，所述的产物核酸编码VH结构域并且任选将由此产生的VH结构域与一个或多个VL结构域结合而提供VH/VL组合；和/或表达所述产物核酸的核酸，所述的产物核酸编码VL结构域和将由此产生的VL结构域与一个或多个VH结构域结合而提供VH/VL组合；选择结合生腱蛋白C的包含VH结构域或VH/VL组合的特异性结合成员；和回收结合生腱蛋白C的特异性结合成员和/或编码结合生腱蛋白C的特异性结合成员的核酸。