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　　[0002] 蛋白质翻译后修饰十分重要，通过亚基的加减改变蛋白质的空间结构，从而影响 其功能和相互作用，甚至影响蛋白质本身的稳定性。常见的蛋白质翻译后修饰包括磷酸化、 泛素化、乙酰化、糖基化等等，这些修饰决定着一些重要蛋白的活性，在多数生理代谢通路 中起着分子开关的作用。乙酰化是指在蛋白质翻译完成后，通过乙酰基转移酶在蛋白质N 端残基上增加乙酰基的修饰。乙酰化在蛋白质功能和结构的稳定性中起着重要的作用。组 蛋白、p53、tubulin等蛋白均存在乙醜化状态，在其乙醜化状态，染色质蛋白和代谢相关酶 高度集中，提示乙酰化修饰对基因表达和代谢具有相当大的作用。在细菌中，和中心代谢有 关的蛋白质90%以上是被乙酰化的，提示乙酰化修饰的范围十分广泛。乙酰化修饰一般发 生在赖氨酸（K)，而在电荷状态上来看，精氨酸（R)和去乙酰化的氨基酸相似，因此，常用赖 氨酸一精氨酸突变（KR突变）来模拟去乙酰化状态。通常情况下，乙酰化反应和去乙酰化 反应是由组蛋白乙酰转移酶（HAT)和去乙酰化酶（HDAC)催化的，虽然HAT和HDAC被称为 组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶，但实际上他们也可以对非组蛋白进行乙酰化和去 乙酰化的修饰。

　　[0005] 除了磷酸化，Beclinl的泛素化也被确定报道过。Beclinl的泛素化修饰是通过 泛素K63标记的，TRAF6是Beclinl的泛素化修饰酶并鉴定出2个Beclinl的TRAF结合 结构域，位于Beclinl蛋白BH3结构域中的K117位点是K63的主要泛素化结合位点，即是 Beclinl最主要的泛素化位点。在巨噬细胞给予炎症因子刺激或氨基酸剥夺，可通过TRAF6 介导促使Beclinl泛素化，而后与Bcl-2解离，激活自噬途径，而去泛素化酶A20可有效拮 抗TRAF6的自噬激活作用。抑制泛素特异性肽酶USP10和USP13对Beclinl的去泛素化作 用，可以促使Beclinl和Vps34复合物降解，从而抑制自噬发生。

　　[0011] Beclinl主要包括BH3、CC、ECD这3个结构域。BH3结构域包含105-125氨基酸 位点，是Beclinl和BCL2/BCL-XL家族结合的主要部位，通过与这些抗凋亡抗自噬蛋白的 结合调节自噬和凋亡过程的发生。CC结构域参与了 Beclinl与UVRAG、ATG14/Barkor等形 成二聚体，这些复合物在自噬的发生中起着重要的作用。E⑶占据了 BeclinlC端约一半的 氨基酸，该结构域和目前已知的所有其他蛋白质的结构域均不具有同源性，但几乎参与了 Beclinl所有的功能，因此E⑶机构可能是破译Beclinl新功能的一个突破口。狭义的EOT 结构域包含244-337氨基酸位点，而广义的E⑶结构域则包括整个1/2的BeclinlC端氨基 酸。按照后者的定义，本发明涉及的K416位点即位于Beclinl的ECD结构域，有可能承担 着新的功能。K416R突变虽然并未完全阻断Beclinl的乙酰化，但却对Beclinl的蛋白量和 自噬的发生产生了较大的影响。和野生型（WT)的Beclinl相比，K416R突变的Beclinl蛋 白表达显著下降。

　　[0029] 本发明先采用IP的方法确定了 Beclinl是否可以被乙酰化。结果显示， ACE-Beclinl处条带明显存在，且随着去乙酰化酶抑制剂NAM+TSA(NT)的作用时间延长不 断加深，约在6小时处条带最为明显。由此，Beclinl存在乙酰化状态，可以被乙酰化。确定 Beclinl可以被乙酰化后，我们继而寻找Beclinl的乙酰化位点。乙酰化位点的预测有多种 方法，LC/LC-MS/MS质谱分析是比较常用的方法，但花费较高，实际操作有一定的难度。使 用软件或网站预测比较简单易行，但是假阳性率较高。在位点突变后进一步进行IP实验分 析，才能确定该位点是否为乙酰化位点。在预测Beclinl的乙酰化位点时，采用了北京大学 团队创建的ASEB网站，预测到BeclinlK416位点被乙酰化的概率较高，于是采用定点点突 变的方法对该位点进行了 KR负义突变，试图模拟Beclinl的去乙酰化状态。结果显示，该位 点突变后Beclinl的乙酰化状态略有降低，但不十分明显，说明该位点可能参与了 Beclinl 的乙酰化修饰，但不是主要位点。尽管如此，该位点突变可使Beclinl蛋白表达显著下降。