Dogecoin - An open-source peer-to-peer digital currency (访问: hash.cyou 领取999USDT）

　　生长不仅与正常发育而且与异常状况诸如肿瘤发生和癌症密切相关。尽管它重要，然而我们对生长如何在细胞水平、组织和器官水平、或者整个生物体水平得到调控仍然了解得较少。由于生长通常与细胞增殖有关，因此为了理解调控生长的机制而进行的许多努力集中于细胞周期调控的机制。事实上，我们关于细胞如何进行细胞周期的知识已经大大增加(Nurse，2000)。对细胞分裂控制的专注导致推测生长受到控制细胞周期的因素的调控。然而，在果蝇成虫盘中进行的精致实验提醒了我们过去在酵母中的发现，即是生长调控着细胞周期而非相反(Nurse，1975)。果蝇实验显示，在细胞克隆中加速细胞周期时间并不刺激净生长(通过克隆占据的面积进行测量)，而是生成了更多但更小的细胞来占据与对照克隆相同的面积。相反，通过过度表达RB同系物RBF来减缓细胞周期则生成了更少但更大的细胞，同样占据相同面积(Neufeld、de la Cruz等人，1998)。因此，理解正常和异常发育过程中的生长调控需要的不仅是对细胞周期控制的理解。理解生长如何在细胞和组织水平得到调控也将为癌症治疗提供新方法和目标。事实上，阻断细胞生长的抑制剂诸如雷帕霉素目前在临床试验中作为抗癌药物使用(Hidalgo和Rowinsky，2000)。因此，迫切需要能够诊断和治疗过度增殖病的方法。

　　为了鉴定在细胞、组织和生物体水平上特异性地参与生长的基因，发明人在果蝇中采用了遗传方法。他们在基因组范围内筛选阻碍或促进细胞生长且不影响细胞分化的隐性突变。这些筛选利用了生成遗传嵌合果蝇的组织特异性重组系统(Newsome、Asling等人，2000)。这些果蝇在头部组织中对随机诱导的突变而言是纯合的，但是在身体和种系中对相同突变而言是杂合的。其产物选择性促进生长的基因(潜在的致癌基因)中的突变将生成小头果蝇，而其产物发挥生长抑制功能的基因(潜在的肿瘤抑制基因)中的突变将生成大头果蝇。通过这种筛选找到涉及肿瘤发生的基因的有效性由下面的鉴定得到了例证，即已知致癌基因的果蝇同系物像雷帕霉素的作用靶TOR、Myc、Ras中的突变引起小头表型，而已知肿瘤抑制基因同系物像PTEN、LATS和TS1中的突变引起大头表型(Huang、Potter等人，1999；Oldham、Montagne等人，2000)。

　　本发明所描述的基因中的突变生成头比正常更大的果蝇(图1)，有力地说明了它具有实质性的生长抑制功能。该基因稍后经鉴定是全新的，并由于与果蝇Epsin蛋白质享有共同结构域而被命名为Epsin样蛋白质(ELP)。在涉及由受体介导的内吞和生长受体的调控(Carbone，1997；Nakashima、Morinaka等人，1999)的所有Epsin家族蛋白质中都发现有(Rosenthal，Chen等人，1999)这个结构域，称为Epsin氨基末端同源性(ENTH)结构域(Kay、Yamabhai等人，1999)。然而，ELP缺乏Epsin中涉及内吞的两个重要结构域与Eps15相互作用的C末端NPF结构域(Chen，Fre等人，1998)和结合网格蛋白接头AP2(Robinson，PJ、Liu，JP，Trends in neuroscience，1994)和网格蛋白(Rosenthal、Chen等人，1999)的DPW中心基序。由于ENTH结构域的三维结构与犰狳重复片段之一类似，因此推测该结构域可能也介导核-胞质穿梭(Hyman、Chen等人，2000；Vecchi、Polo等人，2001)。

　　在第二个方面中，本发明涉及编码ELP蛋白质的核酸序列。本发明还包括确实导致ELP氨基酸序列变化的DNA序列多态性。本领域熟练技术人员将认识到，由于天然等位基因变异，在指定物种的个体中，编码具有ELP多肽活性的多肽的核酸中可以有一个或多个核苷酸(可多达大约3-5％的核苷酸)中存在这些变异。编码epsin样蛋白质的活性片段的核酸片段也属于本发明的范围之内。在用于本文时，elp基因片段指核苷酸数目少于编码SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所列ELP完整氨基酸序列的核苷酸序列的核酸，然而优选编码保留全长蛋白质的一些生物学活性或者在存在合适激动剂/拮抗剂时恢复一些生物学活性的肽。本发明范围内的核酸片段包括那些能够在高或中严谨条件下与来自其它物种的核酸杂交的核酸片段，用于在筛选方案中检测并分离其它elp等位基因和/或同系物，以及那些能够与来自人样品的核酸杂交的核酸片段，用于检测编码ELP蛋白质(包括其它异构体，如mRNA剪接变体)的核酸的存在。本发明范围内的核酸还可包含接头序列、经修饰的限制性内切核酸酶位点、以及对选定多肽的重组形式的分子克隆、表达或纯化有用的其它序列。

　　在优选实施方案中，诊断方法的特征是包括在受试者(如人患者)的组织样品中检测特征为下述中至少其一的遗传损伤的存在与否(1)编码epsin样蛋白质的基因的突变或(2)epsin样蛋白质的错误表达。作为例证，可以通过确定下述中至少一项的存在与否来检测这些遗传损伤(1)编码epsin样蛋白质的基因中一个或多个核苷酸的删除、(2)编码epsin样蛋白质的基因中一个或多个核苷酸的添加、(3)编码epsin样蛋白质的基因中一个或多个核苷酸的替代、(4)编码epsin样蛋白质的基因的总染色体重排、(5)编码epsin样蛋白质的基因的信使RNA转录本水平的总改变、(6)编码epsin样蛋白质的基因的信使RNA转录本的非野生型剪接模式的存在、(7)epsin样蛋白质的非野生型水平、和(8)elp基因5′非翻译区或3′非翻译区中的突变。

　　在一个优选实施方案中，抗体对于脊椎动物诸如哺乳动物的ELP蛋白质的抗原性决定簇具有免疫特异性。用ELP蛋白质的抗原性制剂免疫动物后，可以获得抗ELP抗血清，如果需要，还可以由血清分离多克隆抗ELP抗体。为了生成单克隆抗体，可以由免疫动物收获抗体生成细胞(淋巴细胞)，并通过标准体细胞融合流程与永生化细胞诸如骨髓瘤细胞融合以生成杂交瘤细胞。这些技术在本领域是众所周知的，包括例如杂交瘤技术(最初由(Kohler和Milstein，1983)开发)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbar，1983)、和用于生成人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole，1985)。可以在免疫化学上对杂交瘤细胞筛选与ELP蛋白质特异反应的抗体的生成，并由包含这些条交瘤细胞的培养物分离单克隆抗体。

　　针对ELP多肽或ELP变体的单克隆和多克隆抗体(Ab)以及抗体片段诸如Fab和F(ab)2可用于阻断一种或多种ELP蛋白质的作用，并能够用于研究这些蛋白质在例如胚胎发生和/或不同组织维持中的作用。在一种相似方法中，可以将生成抗ELP单克隆抗体的杂交瘤或其中悬浮有抗ELP抗体的生物可降解凝胶植入意欲阻断ELP作用的区域内或其附近部位。这种性质的实验有助于阐述可能涉及生长调控的这种和其它因素的作用。抗体也非常适合于作为工具用于鉴定与ELP蛋白质有关的疾病或其素质的诊断测定法中，如通过检测ELP蛋白质表达的减弱或增强，通过检测ELP蛋白质的细胞错误定位，或者通过检测个体的组织或体液样品如血液中的异常ELP蛋白质来进行。所述异常形式的ELP蛋白质可能是例如不完全或不同剪接的结果，所生成的较短或较长的ELP蛋白质具有与野生型ELP蛋白质相比有所增强或减弱或不同的活性。此外，所述异常ELP蛋白质形式可以是嵌合蛋白，其中全长ELP蛋白质或其片段与另一种蛋白质或其片段融合。所述嵌合蛋白可以来自例如两种基因之间的删除，或者是基因组重排的结果。本领域熟炼技术人员知道使用抗体在组织和/或体液样品中检测蛋白质的合适方法。所述方法包括但不限于Western印迹、酶联免疫吸收测定法(ELISA)、基于细胞的ELISA、免疫沉淀、带或点印迹、放射免疫测定法、和荧光免疫测定法。

　　本发明的另一个方面涉及通过RNA干扰(RNAi)手段使elp基因发生转录后沉默。RNAi是已经在植物、线虫、无脊椎动物生物体和哺乳动物细胞培养物中发现的由短双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默的一种形式(Ngo、Tschudi等人，1998；Vaucheret和Fagard，2001；Kennerdell和Carthew，1998；Caplen、Fleenor等人，2000；Elbashir、Harborth等人，2001；Timmons、Court等人，2001)。双链RNA(dsRNA)显示可诱导降解反应，其中与短dsRNA互补的单链RNA快速降解(Montgomery和Fire，1998；Montgomery、Xu等人，1998)。RNAi由此可用于降低基因表达，例如在完整生物体或者无脊椎动物和脊椎动物细胞系中的基因表达(Kennerdell和Carthew，1998；Caplen、Fleenor等人，2000；Clemens、Worby等人，2000；Elbashir、Harborth等人，2001)。可以由cDNA或基因组DNA模板生成ELP dsRNA，只要dsRNA中的大部分对应于外显子区域即可。通常，700-800碱基对的靶区域是活性最高的。然而，已知短至200碱基对和长至2000碱基对的dsRNA也具有有力的干扰活性。可以由每一端都包含例如T7、SP6、或T3启动子的PCR片段同时合成RNA的两条链。可以通过用包含例如T7聚合酶结合位点的2种引物扩增ELP cDNA或基因组DNA来生成这种PCR片段。然后可以用包含ELP序列的合适模板进行PCR反应。Taq聚合酶生成最高产量，但是也可以使用另一种聚合酶像Pfu。前10个循环应当包含40℃退火步骤，随后的35个循环包含55℃退火步骤。需要时，可以添加DMSO至终浓度5％。苯酚-氯仿抽提和NH4OAc中的乙醇沉淀可用于将PCR模板与反应混合物分离，然而也可以使用其它商品化PCR纯化试剂盒。可以在含1μg PCR DNA模板的50μl体积中使用适当的RNA聚合酶进行RNA合成反应。购自Ambion的MEGAscriptTM试剂盒效果很好。RNA在合成反应过程中变成双链。可以用不含RNA酶的DNA酶除去DNA模板，并且可以通过酚-氯仿抽提和乙醇沉淀来纯化dsRNA。来自1μgDNA模板的常规RNA产量范围为80-120μg。dsRNA可以作为NaOAc/乙醇沉淀保存于-80℃直至使用。

　　实施例1针头筛选(pinhead screening)胰岛素受体信号途径的成分中的突变以细胞自主方式削弱细胞生长(Bohni、Riesgo-Escovar等人，1999；Verdu、Buratovich等人，1999；Weinkove、Neufeld等人，1999；Brogiolo、Stocker等人，2001)。突变细胞的克隆具有严重的生长缺陷，而且与它们的野生型姐妹克隆相比显得较小。如果通过持续提供flp重组酶来促使有丝分裂重组的发生而且通过细胞致死突变的手段消除姐妹克隆，那么这些克隆可能覆盖整个器官的实质部分。在无眼调控序列的控制下驱动flp重组酶的表达导致只在眼成虫盘中形成组织特异性克隆。联合同源染色体上的细胞致死突变后，该系统能够生成主要由对于目的基因而言是纯合突变体的细胞组成的眼和头壳(Newsome、Asling等人，2000)。这些在眼成虫盘的后代中特异缺乏IRS同系物Chico或胰岛素受体(Inr)的功能的嵌合果蝇显示非常有特点的表型。尽管它们的身体是正常大小的，但是眼和头显著缩小(Bohni、Riesgo-Escovar等人，1999；Brogiolo、Stocker等人，2001)。为了根据相似表型鉴定生长调控基因中的突变，将在第3条染色体右臂基部附近携带flp重组酶靶位点的雄性果蝇(82FRT)进行EMS诱变并与引入以下四种元素的雌性果蝇进行杂交重组酶(ey-flp)来源、对应位置的FRT位点、显性眼标记(w+)和细胞致死突变(c13R3)。在F1代的嵌合果蝇中，可以在头和眼中观察到在3R上最新诱导的突变的纯合性的结果。易于通过丧失色素标记w+而导致白眼组织来显现纯合突变组织的存在。

　　减数分裂和SNP作图显示过度增殖表型的四个互补组之一由四个等位基因组成。使用下面的遗传标记对一个代表性等位基因进行减数分裂作图在细胞学位置87E携带P元件的微型w+、在90E携带P元件的w+、和在96E携带P元件的y+(Xu和Rubin，1993)。使用相同区域内的缺陷通过互补分析确认该粗略的作图定位并精制。通过评估等位基因与附近经标记P元件插入片段之间的重组频率来进行更高限制性的作图。用于作图的P元件是EP(3)0738(94A1-2)、1(3)j5B5(94A1-2)和1(3)L3560(94A5-7)。通过这种方式，能够将突变的遗传位置缩小至染色置94A，极其接近P元件插入点1(3)L3560。

　　实施例2ELP在黑腹果蝇中的表达可以在果蝇中在整个生物体中、在特定器官中、或在特定细胞类型中在整个生命过程中或只在特定发育阶段以不同水平表达特定转基因。可以在(Brand，1993；Perrimon，1998；Perrimon，1998)中找到果蝇遗传学中所使用的标准方法的综述。作为推定的肿瘤抑制基因，预计野生型或突变型ELP蛋白质的过度表达会干扰生长。为了证明这个假设，将携带UAS转基因(编码野生型果蝇ELP蛋白质)的转基因果蝇与在不同组织特异性启动子控制下表达Gal4的果蝇交配(图6和表2)。Gal4驱动的构建物包括但不限于无眼-Gal4、残翅-Gal4(vestigal-Gal4)、MS1096-Gal4(Capdevila和Guerrero，1994)。通过相似方式，有可能测试具有氨基酸替代或内部删除的突变型蛋白质的功能。

　　为了确认果蝇与人ELP之间的功能同源性，将人和果蝇全长ELPcDNA克隆到果蝇表达载体中，像pUAS转化载体(Phelps和Brand，1998)。可以依照(Basler和Hafen，1988)中描述的方法生成转基因果蝇。转基因交配到对于两个elp突变型等位基因之任一而言为反式杂合的果蝇中，其中还包含能够普遍或组织和/或阶段特异表达UAS-转基因的Gal4转基因。该Gal4转基因包括但不限于肌动蛋白-Gal4、微管蛋白-Gal4、和热休克-Gal4。如表1所示，由幼虫晚期至蛹阶段，果蝇和人转基因的普遍表达确实至少部分挽救了与elp突变型等位基因的反式杂合性有关的致死性。这说明help基因是果蝇elp基因的功能同源物(见图6)。

　　或者，可以在包含微管蛋白启动子的转化载体的下列序列中插入果蝇和人全长cDNA微管蛋白启动子-FRT-cDNA终止子-FRT-Gal4(缩写tub＞cDNA＞Gal4)。通过这种方式，挽救转基因受到微管蛋白启动子的直接控制，导致ELP表达的生理学水平低于或可能高于Gal4体系。另外，在ELP突变体背景中，可以通过在热休克诱导型启动子或组织特异性启动子的控制下表达FLP重组酶而在细胞克隆中切除elpcDNA。以这种方式生成的突变细胞可以通过UAS-GFP报道分子的手段得到识别，因为在这些细胞中Gal4是由微管蛋白启动子驱动的。Kramps等人(Cell，10947-60，2002)最近描述了这种方法。

　　然后可以纯化表达的GST标记-ELP，例如使用亲和珠或亲和层析，诸如谷胱甘肽珠(如购自Pharmacia)。如下通过裂解表达Lgs的细菌来制备提取物，即将细胞悬浮于超声处理缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、1mM EDTA、1.5％肌氨酰、2％屈力通-X-100、1mMDTT和蛋白酶抑制剂)中，随后在冰上短暂超声处理(如3次，每次20秒，中等力度)，并离心。然后将澄清的上清液在温和旋转下例如与谷胱甘肽珠一起于4℃保温1小时。接着将珠用清洗缓冲液(20mMTris-HCl pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mM MgCl2、0.5％NP40)清洗几次，并最终保存于储存缓冲液(20mM Tris-HClpH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mM MgCl2、10％甘油、0.5％NP40、和蛋白酶抑制剂)中。或者，可以使用Ni2+螯合物亲和层析或者使用蛋白A或蛋白G柱层析而分别纯化组氨酸标记或IgG标记的ELP。

　　可以进行GST融合蛋白体外结合测定法来例如对结合结构域作图、确认相互作用配偶体、或寻找额外的相互作用蛋白质。为此目的，遵循制造商提供的指示，使用包含[35S]甲硫氨酸的网织红细胞裂解物(TNT-裂解物，Promega Corporation)在体外翻译(IVT)蛋白质。将如实施例6所述生成的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白固定在谷胱甘肽-Sepharose上并在结合缓冲液(20mM Tris pH8.0、200mM NaCl、1mMEDTA、1mM DTT、1mM MgCl2、10％甘油、0.5％NP40、0.05％BSA、和蛋白酶抑制剂)中封闭45分钟。然后将2μg固定化的GST蛋白质与0.5-4μl IVT蛋白质在结合缓冲液中一起保温1.5小时。将珠用清洗缓冲液(20mM Tris pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mMMgCl2、0.5％NP40)清洗4次，并在Laemmli SDS样品缓冲液中煮沸。必须通过SDS-PAGE分析分别使用考马斯染色或放射自显影确认使用了等量的完整GST融合蛋白与cDNA的成功IVT。

　　可额外进行酵母双杂交测定法，以确认上文所述体外结合测定法的结果，或者用于对cDNA文库筛选新的相互作用配偶体(Fields和Sternglanz，1994)。为了确认特异结合或定位ELP与相互作用配偶体之间的结合区域，将期望cDNA亚克隆到将其连接Lex DNA结合结构域(如pLexA，Clontech)或酸激活结构域(如pGJ4-5，Clontech)的适当酵母表达载体中。然后通过醋酸锂-聚乙二醇法将适当的质粒对与报道质粒(如pSH18-34，Clontech)一起转化到适当酵母菌株(如EGY48)中并在选择性培养基上进行培养(Sambrook、Fritsch等人，1989)。如所用载体-报道质粒的制造商所述分析转化子的报道基因活性。为了确定重复性，在两个方向上都测试相互作用。

　　为了分离新的ELP结合蛋白(Bartel、Fields，《The Yeast two-HybridSystem》即《酵母双杂交系统》，Oxford UP，1997)，用β-半乳糖苷酶报道质粒、与LexA DNA结合结构域序列融合的包含ELP cDNA或其部分的酵母表达载体(“诱饵载体”)以及包含与cDNA序列集合融合的转录激活结构域的第二种酵母表达载体(“猎物载体”库，如RFLY10-12h胚胎文库，PNAS，93，3011及其后中所述)转化适当酵母菌株。然后将包含报道质粒以及诱饵和猎物载体的三重转化子在选择性培养基上进行培养，并选择营养缺陷型和β-半乳糖苷酶报道分子的相互作用依赖性激活。由选择的克隆再次分离各个猎物构建物，并通过检查不存在与无关诱饵构建物的相互作用来评估诱饵/猎物相互作用的特异性。最后，将经过确认的相互作用物测序，装配全长cDNA，并再次测试与诱饵的特异相互作用。

　　实施例8免疫组织化学可以使用本发明提供的抗ELP抗体在果蝇胚胎、成虫盘、成熟组织切片、脊椎动物肿瘤细胞系、或脊椎动物组织上进行ELP蛋白质的定位。例如，若使用经转化细胞系像HEK293细胞(ATCC)，则将细胞接种到用聚赖氨酸包被的8孔板(Nalge-Nunc国际公司)中，并于37℃培养过夜。第二天，将细胞用3.7％甲醛在PBS中固定10分钟，在0.5％屈力通-X-100中透化处理10分钟，并用1∶1000稀释的预免疫血清在2％BSA-PBS中于室温封闭1小时。然后将细胞与1∶2000稀释的由本发明提供的抗ELP多克隆兔免疫血清于室温保温2小时。将载玻片用PBS清洗3次，每次5分钟，并与1∶200稀释(v/v)的与TRITC缀合的猪抗兔免疫球蛋白(Dako公司)一起保温。重复清洗步骤后，使用Vectashield封装介质(Vector Laboratories公司)覆盖盖玻片。作为特异染色的阳性对照，可以通过例如脂转染法用ELP表达质粒诸如pcDNA3.1(Invitrogen)转染部分细胞。转染后两天，如上所述用抗ELP抗体将对照细胞染色。

　　制备ELP dsRNA可以由cDNA或基因组DNA模板生成ELP dsRNA，只要大部分dsRNA对应于外显子区域即可。通常，700-800碱基对的靶区域是活性最高的。然而，已知短至200碱基对和长至2000碱基对的dsRNA也具有有力的干扰活性。可以由每一端都包含例如T7、SP6、或T3启动子的PCR片段同时合成RNA的两条链。可以通过用包含例如T7聚合酶结合位点的2种引物扩增ELP cDNA或基因组DNA来生成这种PCR片段。引物互补序列的长度应当是20-24个核苷酸，22个核苷酸是最佳的，且Tm为60℃是最佳的。每种引物的5′端应当对应于例如27个核苷酸的T7启动子序列。然后可以用包含ELP序列的合适模板进行PCR反应。Taq聚合酶生成最高产量，但是也可以使用另一种聚合酶像Pfu。前10个循环应当包含40℃退火步骤，随后的35个循环包含55℃退火步骤。需要时，可以添加DMSO至终浓度5％。苯酚-氯仿抽提和NH4OAc中的乙醇沉淀可用于将PCR模板与反应混合物分离，然而也可以使用其它商品化PCR纯化试剂盒。可以在含1μg PCR DNA模板的50μl体积中使用适当的RNA聚合酶进行RNA合成反应。购自Ambion的MEGAscriptTM试剂盒效果很好。RNA在合成反应过程中变成双链。可以用不含RNA酶的DNA酶除去DNA模板，并且可以通过酚-氯仿抽提和乙醇沉淀来纯化dsRNA。来自1μg DNA模板的常规RNA产量范围为80-120μg。dsRNA可以作为NaOAc/乙醇沉淀保存于-80℃直至使用。

　　将ELP dsRNA转染到果蝇S2细胞中在补充10％FCS的Schneider S2果蝇培养基(GIBCO)中扩增S2细胞。转染前一天，将1百万个细胞接种到6孔板中，并于25℃培养过夜。然后使用阳离子脂质CellFectine(GIBCO)使用制造商方案的改版转染细胞。简而言之，将合计5μg DNA和dsRNA与20μl CellFectine脂质混合物在1.2ml无血清生长培养基(如DES表达培养基，Invitrogen，卡尔斯巴德，美国)中复合。将复合物于室温保温15分钟，然后加到细胞中，并用1ml无血清培养基更换普通的生长培养基。4小时后，向细胞中加入1.2ml补充30％FCS的生长培养基。转染后一天，用含10％FCS的新鲜培养基更换培养基。转染后2天开始可以对细胞进行测定(如ELP蛋白质水平或Tcf转录活性)。