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　　Camelid single-domain antibody fragments (“nanobodies”)骆驼单域抗体片段（“纳米抗体”）在单个15 kDa免疫球蛋白VHH域内具有显著的抗体特异性。这一独特的功能使其应用范围从生化研发领域扩大到临床治疗。Nanobodies已成为蛋白质结构生物学中特别有用的工具，有助于研究构象动态蛋白质，如G蛋白偶联受体（GPCR）。迄今为止，几乎所有可用的纳米抗体都是通过动物免疫获得的，这一瓶颈（bottleneck）大大限制了纳米抗体的应用。为了解决这个问题，文章报道了一个基于酵母表面展示的完全体外纳米抗体发现平台（a fully in vitro platform ）。提供了识别纳米抗体的blueprint ，通过将纳米抗体与其抗原结晶（Crystallize）来证明文库的效用。

　　抗体由于其特殊的特异性和生化的多功能性，对科学和医学产生了变革性的影响，使其能够应用于生物医学研究的几乎每一个方面。传统抗体由两条重链和两条轻链组成。它们中的每一个都通过一个可变结构域(重链和轻链分别称为VH和VL)促进抗原结合的特异性。在骆驼类(大羊驼、骆驼、羊驼等驼类)中发现了一个例外，它们拥有完全由重链组成的平行抗体库。这种抗体通过一个可变结构域(VHH)与目标抗原结合，该结构域包含整个抗原结合表面。与传统抗体的抗原结合片段(Fab)不同，分离出的VHH结构域(也称为“纳米抗体”)可以作为单一基因的产物在细菌中表达，在许多情况下，这些结构域甚至可以在真核细胞质的还原环境中折叠并保持抗原特异性。由于其多功能性，纳米抗体已在蛋白质结构生物学和细胞生物学中得到应用，并作为潜在的诊断和治疗药物。

　　这个恒定的框架区与互补决定环(CDR)的设计变化相结合，CDR构成了VHH的高度可变的抗原结合界面。对PDB中整套独特的纳米体(分析时为93条序列)在CDR中的位置特异性变化进行了分析，合成抗体库的设计旨在重现这种多样性。对于紧挨着CDR的残基，引入部分随机化（partial randomization ），只允许由PDB中观察到的纳米抗体频率引导的少数可能的氨基酸。对于每个CDR中高度可变的位置，引入更彻底的随机化（thorough randomization ）来反映这些位置的高度多样性。首先，确定PDB中所有纳米抗体中CDR3中每个氨基酸的频率。合成的氨基酸混合物经过修饰以消除半胱氨酸（C）和蛋氨酸（M）以避免化学反应，并被引入到合成文库中每个CDR的不同位置。通过对纳米抗体序列的分析，选择在CDR1和CDR2中分别引入四个高度可变的位置。较长的CDR3代表了一个对抗原识别至关重要的Loop——在这里，引入7个、11个或15个连续的高度多样性混合物位置，以模拟在自然库中看到的CDR3长度变化(图1A - C)。

　　合成了包含所需序列多样性的引物，使用trimer phosphoramidite mixture构建了高多样性区域，以匹配目标密码子频率。然后，通过这些引物的聚合酶链反应(assembly PCR)建立了一个汇集了纳米体完整序列的DNA文库。合成抗体片段的一个普遍但往往不被重视的缺点是较差的生化行为。在产生大型酵母显示文库之前，先需要评估文库设计是否能够可靠地产生适合于结构和细胞生物学研究的生物化学可处理的克隆。从文库中随机选择11条纳米体序列，通过表达和纯化从大肠杆菌中检测其生化行为。在这些克隆中，9个表达良好(20 mg/L)，可以通过常规程序纯化，并显示合理的单分散尺寸排除谱(Supplementary Figure 1; Supplementary Table 1)

　　接下来，将纳米抗体和其他小蛋白固定在酿酒酵母和其他酵母物种的表面。此前已经报道了多种方法来实现这一目的，最常见的方法是将感兴趣的蛋白质与酵母细胞壁蛋白Aga2p融合。虽然这一策略已被广泛应用，但由于需要使用表达半乳糖诱导Agalp的工程酵母菌株，从而将Aga2固定在酵母细胞壁上，因此受到限制。取而代之的是，作者建立了一个简化的系统，在该系统中，the protein of interest目标蛋白通过单一的系索（a single tether ）直接连接到细胞壁，该系索（a single tether ）旨在取代Aga2p-Agalp连接蛋白。设计了一种模拟酵母细胞壁蛋白低复杂度序列的合成tether，并对其将测试蛋白固定在酵母细胞壁上的能力进行了评估。该蛋白的可及性与染色试剂的分子量密切相关，提示细胞壁聚糖的空间闭塞。与这一解释一致的是，较长的链系tethers缓解了这一问题，超过600个氨基酸的长度，染色水平的分子量依赖性可以忽略不计(Supplementary Figure 2)。

　　在此基础上，将工程表面展示质粒(pYDS649)线性化，将其与DNA文库一起转化到酿酒酵母蛋白酶缺失株BJ5465中，并扩增出与pYDS649同源的侧翼序列进行重组。这导致了5 × 108个转化体的产量。虽然与一些文库相比，这是适度的，但我们在下面展示了我们的方法产生的克隆与通过动物免疫获得的相似，证明了我们基于结构的文库设计的价值。为了鉴定得到的酵母表面展示文库，从-60万个酵母细胞中分离质粒DNA并进行高通量测序。对48万个独特序列的分析证实，文库克隆在CDR环的高可变部分具有所需的氨基酸频率(Figure 1C)，也证实了CDR-flanking区域的多样性与目标频率相似。总的来说，通过流式细胞仪检测，26%的文库酵母显示纳米抗体高表达。综上所述，这些数据意味着该文库包含至少10E8个独特的全长纳米体克隆，能够在酵母表面表达和显示。

　　为了识别新的HSA结合纳米体，首先制备了荧光标记的HSA蛋白，然后使用它进行迭代染色和基于磁珠的富集。简而言之，这种方法需要用荧光HSA抗原孵育酵母文库，洗去多余的抗原，然后用抗荧光团磁性微珠进一步对所需克隆进行染色。标记细胞通过磁分离分离，在标准酵母培养基中扩增(Figure 1E)。与任何基于文库的选择一样，最重要的是确保binders识别抗原本身，而不是用于分离的试剂或荧光标记。为了达到这种特异性，在每个选择步骤之前，酵母与beads单反应从文库中被耗尽。为了降低荧光团结合剂富集的可能性，所使用的荧光团标签在Alexa Fluor 647和荧光素异硫氰酸酯(FITC)之间交替进行连续的每轮magnetic selection。

　　Nb.b201与HSA结合的结构基础。Nb.b201在分离时和与HSA复合时都容易结晶。x射线数据收集X-ray data collection得到的数据集对自由纳米体和HSA复合物的分辨率分别为1.4 Å and 2.6 Å(Table 1)。这些晶体结构揭示了Nb.b201采用了之前观察到的动物源纳米体典型的v型免疫球蛋白折叠(Figure 2C – E)。两种结构的比较为比较同一抗体片段的结合状态和自由状态提供了机会。值得注意的是, Nb.b201在与抗原结合时发生了大规模的构象变化，导致CDR3主链和氨基酸侧链的重定向(Figure 2E)。抗原识别模式涉及Nb.b201主要通过其CDR3 loop与靶标结合，HSA与CDR1或CDR2的直接接触相对较少。有趣的是，Nbb201识别的表位是HSA表面的凸出表位，而大多数纳米表位通常是凹面的。相互作用模式包括极性和非极性相互作用的混合，反复出现Tyr-Glu和Tyr-Asp hydrogen bonds（氢键） (Figure 2C)。这些结果不仅揭示了合成纳米抗体-抗原相互作用的机制，而且也证实了在2 - 3周内可以获得用于晶体学的有用纳米抗体，而无需使用专门的设备或大型动物免疫。

　　GPCRs是人类最大的跨膜受体家族，在中枢神经系统功能、代谢调节和心血管生物学等生理机能的各个方面发挥着重要作用。纳米抗体已被证明是GPCRs详细结构和生化表征的宝贵工具。例如，一种稳定β2肾上腺素能受体(B2AR)活性构象的驼胺基纳米体Nb80可以确定激素激活的GPCR4活性构象的第一个x射线的构象选择性也被用于探索活性B2AR在活细胞中的定位，从而揭示了细胞内GPCR信号转导的新范式3。另一个纳米体Nb35有助于研究异源三聚体G蛋白G与B2AR复合物的结构和信号，从而确定了GPCR-G蛋白异源三聚体复合物的第一个结构20。近年来，与gpcr结合的纳米体已经扩展到包括一系GPCRs6。然而，迄今为止报道的所有靶向gpcr的纳米体都可以追溯到动物免疫——这是一种缓慢、昂贵且常常不成功的技术。

　　鉴于构象选择性抗体在GPCR研究中的广泛应用，任何旨在取代基于免疫的方法的体外平台必须能够生成构象选择性GPCR结合物。因此，作者试图利用合成的纳米体库平台来识别选择性结合B2AR活性构象的纳米体(Figure 3)。首先选择纳米体展示酵母通过MACS结合纯化的、Flag标记的B2AR与激动剂BI167107结合。随后，我们引入了一种反选择策略来消除不需要的克隆，包括与M1抗体本身结合的纳米小体、Alexa Fluor 647荧光团、构象不变的表位或不活性的B2AR构象。例如，在第三轮MACS中，首先耗尽了与高亲和力拮抗剂carazolol占据的B2AR结合的克隆，然后富集了与激动剂占据的受体结合的克隆。为了富集所需的激动剂结合B2AR特异性纳米体，进行了两轮FACS。在这里，酵母文库与B2AR占用的激动剂(BI167107)和拮抗剂(carazolol)同时孵育，每个受体配体复合物都标记有特定的Alexa荧光团(Figure 3A – C)。这种使用FACS的专门选择需要一个基于细胞的显示系统。作为选择的克隆与所需的表位结合的标志，大部分克隆与Nb6B9竞争，Nb80先前的亲和成熟变体，以高亲和力结合β2AR 21的细胞内侧。最后，通过降低激动剂结合β2AR浓度的MACS来富集亲和性最高的克隆。

　　对单个克隆进行测序发现，分离出了13个独特的结合激动剂占用β2AR的纳米抗体(Figure 3D; Supplementary Figure 5)。进一步利用酵母滴定法对克隆进行优先排序，结果表明，分离出的纳米体在低至中纳米摩尔范围内对β2AR-BI167107复合物具有一系列亲和力。预计从这个库中识别的构象选择性纳米体将在生化、结构和细胞生物学应用中找到效用。因此，接下来在药理、晶体学和细胞信号实验中验证了活性状态特异性β2AR纳米体。选择4个克隆进行进一步鉴定，并从大肠杆菌中表达和纯化。通过竞争放射配体结合试验评估，4个纳米体均增加了β2AR的激动剂亲和力(图3E)。该金标准药理学分析为每个纳米体稳定B2AR的活性构象提供了明确的证据。接下来，我们使用单循环动力学方法，通过表面等离子体共振(SPR)测定了每个纳米体与bi167107占β2AR的结合亲和性(Figure 3F, G)。测量的亲和性范围为44 nM到151 nM，与研究最广泛的大鼠衍生的gpcr靶向纳米体Nb80相比，其结合亲和性约为140 nM 。

　　此外，评估了我们合成的纳米体在活细胞中调节GPCR信号的潜力，这是羊驼衍生纳米体的一个关键应用。与羊驼衍生纳米体一样，发现合成的纳米体在肾上腺素反应中可以显著削弱β2AR信号。在测试的纳米体中，发现Nbc203是最有效的，使肾上腺素Emax降低45%(Figure 3J)。观察到的最大信号抑制的变异性可能反映了细胞溶胶还原环境中纳米体的亲和力和稳定性。Nb的有效性。尽管C203的亲和力较低，但它强调了测试多个独特克隆对体内应用的重要性。值得注意的是，在这些纳米体存在下观察到的不可克服的抑制与纳米体的G蛋白竞争结合模式一致。与正位抑制剂不同，添加过多的激动剂不能克服纳米体抑制，因为结合位点是不同的。

　　为了进一步研究合成纳米抗体库的通用性，试图识别另一个GPCR的构象选择性纳米体。作为实验案例，选择了人类A2A腺苷受体(A2AR)。这种受体在中枢神经系统中起着重要作用，这一点早已为人所知，最近又成为癌症免疫治疗药物开发的靶点。重要的是，虽然已经报道了一种非活性状态特异性Fab，但并没有针对A2AR的活性状态选择性纳米体。为了生成活性状态特异性纳米体克隆，进行了两轮MACS来生成A2AR结合纳米体库，然后进行一轮FACS来丰富构象选择性结合剂(Figure 4A)。从这个池中，有两个的克隆体Nb.AD101和AD102。选择AD102进行进一步表征。在流式细胞仪结合试验中，每个克隆都表现出对激动剂结合A2AR的强烈偏好(Figure 4B)。为了进一步验证这些克隆，我们表达并纯化了它们，并在体外下拉试验中测量了它们与受体的结合。与基于细胞的染色实验一致，这些纳米小体显示出只与激动剂占用受体结合(Figure 4C)，证实了该方法的通用性。